流體剪切力實(shí)驗(yàn)：流體環(huán)境下的HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)，真實(shí)還原體內(nèi)環(huán)境

這里我們以HUVEC細(xì)胞為例，使用ibidi流體剪切力系統(tǒng)進(jìn)行一個(gè)流體條件下的細(xì)胞培養(yǎng)與靜置狀態(tài)下的細(xì)胞培養(yǎng)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

一.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備

1. 細(xì)胞： HUVECs細(xì)胞系
2. 培養(yǎng)基：Endothelial Cell Growth Medium（PromoCell，Germany，C-22010）

           胎牛血清

1. 培養(yǎng)耗材：ibidi單通道載玻片μ-Slide I0.6 Luer （ibidi，Germany，80186）

             灌流管，15cm，1.6mm直徑（ibidi，Germany，10962）

             封口夾 

1. 儀器設(shè)備：ibidi流體剪切力系統(tǒng)，含空氣泵（ibidi，Germany，10905）和流體單元（ibidi，Germany，10903）

1. 實(shí)驗(yàn)方法

在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前一天，請(qǐng)將所有需要使用的試劑，培養(yǎng)基，通道載玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中放置到第二天，排除由于溫度差產(chǎn)生的微量氣泡。

一.）培養(yǎng)細(xì)胞

準(zhǔn)備HUVECs細(xì)胞系，按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。好使用比較健康的內(nèi)皮細(xì)胞，以防在做流體實(shí)驗(yàn)時(shí)候細(xì)胞不能穩(wěn)定貼壁。我們建議使用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基+10%FCS培養(yǎng)HUVEC。好使用4代以內(nèi)的HUVEC。已獲得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

按照下面流程鋪細(xì)胞：

1. 將150μl的1.6 x 106 cells/ml密度的細(xì)胞懸液加入通道載玻片中，注意，將移液器頭插入注液孔中再加入細(xì)胞懸液，可以輕微傾斜通道載玻片幫助細(xì)胞懸液充滿整個(gè)通道（圖一）。

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2.蓋上注液孔蓋，將通道載玻片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)半小時(shí)，等待細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后，拿出通道載玻片，在每個(gè)注液孔中分別加入60μl培養(yǎng)基，注意，槍頭要懸在孔上方滴入培養(yǎng)基（圖二）

3.將通道載玻片再放入二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)2-4小時(shí)左右，等到細(xì)胞剛剛長(zhǎng)滿為單細(xì)胞層，即可開(kāi)始實(shí)驗(yàn)（圖三）。注意，要使用單層細(xì)胞進(jìn)行剪切力實(shí)驗(yàn)，使每個(gè)細(xì)胞均受到均勻的剪切力。

                                                                           圖三

3.靜置條件下細(xì)胞培養(yǎng)。在通道載玻片中靜置培養(yǎng)的細(xì)胞可以作為流體剪切力條件下培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)照。待流體實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的同時(shí)，將靜置細(xì)胞培養(yǎng)的對(duì)照組放入二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行7天的培養(yǎng)。注意，培養(yǎng)過(guò)程中每天都要更換培養(yǎng)基。

二）搭建流體系統(tǒng)

1. 將灌流管按照說(shuō)明放在置在流體單元上。在灌流管的儲(chǔ)液管中加入12ml培養(yǎng)基。這時(shí)不需要連接通道載玻片。實(shí)驗(yàn)前需要去除整個(gè)灌流管中的氣泡，存留在灌流系統(tǒng)的氣泡會(huì)影響剪切力的大小，有時(shí)還會(huì)使灌流系統(tǒng)中的液體流動(dòng)停滯。打開(kāi)ibidi泵控制系統(tǒng)，在任務(wù)欄中找到“Remove air bubbles”，ibidi流體剪切力系統(tǒng)將自動(dòng)運(yùn)行下面任務(wù)，用于去除氣泡。（表一）

2.連接通道載玻片。去除氣泡后，就可以將之前準(zhǔn)備好的含貼壁細(xì)胞的通道載玻片與灌流管相連。將搭載灌流管的流體單元從流體剪切力系統(tǒng)中取下，放到超凈臺(tái)中。將通道載玻片的注液孔用培養(yǎng)基裝至過(guò)滿狀態(tài)(?）。之后就按照下面的流程圖連接通道載玻片（圖四）。

圖四：a）封口夾輕輕將灌流管的硅膠管夾住。b）將其中一個(gè)魯爾接頭從中間的鏈接管中拔出。c-j）按圖示，將魯爾接頭與通道載玻片的注液孔相連，注意不能產(chǎn)生氣泡，會(huì)有部分培養(yǎng)基溢出。k）連接好后，將封口夾移除，用無(wú)塵紙將溢出的培養(yǎng)基擦除。l）全部連接好后，用顯微鏡觀測(cè)一下通道內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài)。

3）檢查灌流系統(tǒng)是否密封、是否將灌流管插入了正確的閥門。將封口夾夾住其中一根硅膠管，如果兩邊的灌流儲(chǔ)液管液面不會(huì)下降或者上升，那么，整個(gè)系統(tǒng)就是密封的，并且是正確安裝的（圖五）。

                                                       圖五。

4.開(kāi)始流體剪切力實(shí)驗(yàn)（單向?qū)恿鳎⒋罱ê玫牧黧w單元與流體剪切力泵相連后，將整個(gè)流體單元放入二氧化碳培養(yǎng)箱中。打開(kāi)控制軟件，設(shè)置實(shí)驗(yàn)條件與步驟。為了使貼壁細(xì)胞適應(yīng)剪切力培養(yǎng)環(huán)境。先用低剪切力刺激，逐步提高并且保持在一定的剪切力（表二）。

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三 ）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

一.形態(tài)對(duì)比
在培養(yǎng)7天之后，可以直接用顯微鏡觀察到細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了顯著的變化，在剪切力刺激下培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)更加修長(zhǎng)，排列更加緊密和規(guī)律。而靜置狀態(tài)下培養(yǎng)了7天的細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有顯著的變化（圖六）。

圖六：如上所示，在20 dyn/cm2刺激下的細(xì)胞更為修長(zhǎng)排列更加緊密。

1. 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

1. 去除通道內(nèi)培養(yǎng)基。用1mlPBS沖洗通道，在注入PBS的同時(shí)，用槍頭從另一個(gè)注液孔吸出廢液。
2. 加入約200μl的3.7%多聚甲醛的PBS溶液，用槍頭從另一個(gè)注液孔吸出廢液。靜置10分鐘。
3. 按照步驟1）沖洗通道
4. 加入200μl 1% Triton® X-100 的PBS 溶液通透3-5分鐘
5. 按照步驟1）沖洗通道
6. 加入200μl 1% BSA的PBS溶液封閉20分鐘
7. 按照步驟1）沖洗通道
8. 依次加入一抗，二抗進(jìn)行免疫熒光染色后，沖洗通道并加入封片液進(jìn)行顯微鏡觀察（圖七、圖八）。

圖七：HUVEC細(xì)胞在20 dyn/cm2刺激7天的免疫熒光結(jié)果?？梢钥吹郊?xì)胞骨架排列方向非常一致。藍(lán)色：細(xì)胞核；綠色：VE- cadherins；紅色：actin filaments

圖八：靜置狀態(tài)下培養(yǎng)7天的HUVEC細(xì)胞，可以看見(jiàn)細(xì)胞骨架排雷沒(méi)有規(guī)律性，并且表達(dá)量也略少。

三.實(shí)驗(yàn)總結(jié)
綜上所述，對(duì)于HUVEC細(xì)胞而言，流動(dòng)剪切力的培養(yǎng)環(huán)境更為貼近其自然生長(zhǎng)的環(huán)境，我們實(shí)驗(yàn)說(shuō)明在靜置狀態(tài)下并不能展現(xiàn)出HUVEC細(xì)胞的生理特性。